脊（jǐ）髓（suǐ）性肌萎缩症（zhèng）（spinalmuscularatrophy，SMA）是一（yī）种常染色体隐性遗（yí）传病，居儿童致死性常染色体隐性遗传病的（de）第2位。位于染色体（tǐ）5q11.2～q13.3上的运动神经元存活基（jī）因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致（zhì）病基因。

　　人基因组有两（liǎng）个紧邻（lín）的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，两者仅（jǐn）有5个碱基不（bú）同。SMN1是主要功（gōng）能基因（yīn），该基因突变可导致（zhì）SMA发（fā）病，SMN2为临床表型（xíng）的调（diào）节基因，影响病情的严（yán）重程度，其拷（kǎo）贝数增加可减轻SMA表型（xíng）。目前已知约94％的SMA患者（zhě）为SMN1基因第7和（或）第8外显（xiǎn）子纯合缺失所致，少数病例（lì）可由SMN1基因点突（tū）变或小的（de）缺失引起。

　　SMN1基因外显子缺失检（jiǎn）测的意义（yì）

　　SMA在人群中（zhōng）的发病率为（wéi）1/5000～1/10000，群体携带者频率为（wéi）1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因（yīn）此极有必要进行SMA携带者的人群筛查，并通过（guò）产前诊断技术降低人群中SMA患儿的出生（shēng）率（lǜ）。

　　临床上将SMA分（fèn）为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型（xíng）、中（zhōng）间型和少年型（xíng），严（yán）重程度依次递（dì）减。神经专科医生一般根据患者（zhě）发病年（nián）龄、临（lín）床表（biǎo）现及病（bìng）情（qíng）进展程度进（jìn）行临床诊断，辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检，结合家族（zú）史和SMN1基因分析可进（jìn）行（háng）确诊。由于SMA患儿中约94%为SMN1基因外显子纯合缺失，因（yīn）此，SMN1基（jī）因缺失检测对于SMA的诊断具有更高的（de）灵（líng）敏度和特异性。且对（duì）不（bú）同（tóng）型的（de）SMA患者，SMN1纯合（hé）缺（quē）失率没有（yǒu）显著差异，所以（yǐ），SMN1纯合缺失的检测对于不（bú）同型SMA患（huàn）者具（jù）有相同的临（lín）床诊断价（jià）值。在（zài）欧美（měi）人群中，SMN1基（jī）因纯合缺失检测已成为诊（zhěn）断（duàn）和排除诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失检测试剂的现状（zhuàng）

　　目前（qián），SMN1基因外显子缺失检测试剂较为缺乏，临床（chuáng）检验实验室较为公认的方（fāng）法是PCR结合限制性片段长（zhǎng）度（dù）多态（tài）性（PCR-RFLP）的方法。但该方法操作较（jiào）为繁琐，且重（chóng）复（fù）性差（chà），不利于标准化，不易推（tuī）广（guǎng）。同（tóng）时，这种方法（fǎ）只（zhī）能检测出（chū）纯合缺失，无（wú）法确认杂（zá）合缺（quē）失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试（shì）剂可对待测靶序列进行半定（dìng）量（liàng）分析，因此既（jì）可检测纯合缺失，亦可（kě）确认（rèn）杂合（hé）缺失。在国内外已有多篇文（wén）献报道采用该（gāi）方法进行（háng）SMA患者诊断（duàn）和SMA携带（dài）者筛查。但该产（chǎn）品（pǐn）目前仍为“仅（jǐn）用于研究”的试（shì）剂，尚未（wèi）按照体外诊断类医疗（liáo）器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国家食品药品监管总局批（pī）准了第一项SMN1缺失突变检测试剂上市。该（gāi）产品采用（yòng）多重实时荧（yíng）光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单拷贝基因RPP40为内参基（jī）因，对SMN1基因第7外显（xiǎn）子和（hé）第8外显（xiǎn）子拷贝（bèi）数进行相（xiàng）对定量（liàng）检测（cè），用于SMA患（huàn）者的体外辅助分子诊断。SMN1基因（yīn）外显（xiǎn）子缺（quē）失检测的难点之一（yī）在于排（pái）除高同源性基（jī）因SMN2的干扰，特别是对于（yú）SMN2高拷（kǎo）贝（bèi）数的受试者，需（xū）保证结果的准（zhǔn）确（què）可靠。该（gāi）产品通（tōng）过对实（shí）时荧（yíng）光PCR相对定量、绝对定量技术（shù）进行系统整合，并在反应体系中（zhōng）加（jiā）入特（tè）定化学（xué）组（zǔ）分（fèn），以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配，增（zēng）加（jiā）PCR扩增（zēng）的特（tè）异（yì）性，从而有效控制（zhì）SMN2基因非特异性（xìng）扩（kuò）增对检测（cè）结果的（de）影响，准确（què）检出高（gāo）拷贝数SMN2样本中SMN1基因第7和第8外显子的缺（quē）失情（qíng）况。

　　鉴于国内外尚无任（rèn）何按照体外诊断试剂批准上市的SMA分子诊断产品，因此（cǐ）临（lín）床试验（yàn）方案中依据EMQN关于《SMA分子诊断（duàn）最佳（jiā）实（shí）践指南》，采用了国内外SMA体外辅助分子诊断领域公认的PCR-RFLP法作为对（duì）照方法。临床试（shì）验共完成（chéng）1069例，其中正（zhèng）常（cháng）对（duì）照组777例，SMA病例组（zǔ）292例，统计分析结果显示申报（bào）产品与对（duì）比方法检测结果（guǒ）的一致性为100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年（nián）人大样（yàng）本中目标外显子△△Ct分布（bù）范围（wéi）的（de）调查亦显示，该产品（pǐn）的纯合突变（biàn）判（pàn）断界值设置合理。

　　该（gāi）试剂目前批（pī）准的预期用途仅包含（hán）纯合缺失的检测，尚不能（néng）用于杂合缺失的检测，因此无法（fǎ）用于SMA携带者的筛查，这是该产品的缺陷之（zhī）一（yī）。

　　事实上，该产品（pǐn）在设（shè）计上已考虑到SMA携带者的检（jiǎn）测，其检测原理是以待测（cè）样本中目（mù）标外显（xiǎn）子（zǐ）荧光信号Ct值与（yǔ）内参基因荧（yíng）光信号Ct值之差（△Ct_s），与（yǔ）正常（cháng）对照品三个梯度稀（xī）释品中目标外显子荧光信号Ct值和内参基因荧光（guāng）信号（hào）Ct值之差的平均值（△Ct_a）之差（chà），即△△Ct，作为待测样本（běn）中目标外显子拷贝数检测变（biàn）量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧光（guāng）定量PCR相（xiàng）对定量的基本（běn）数（shù）学原理推导得到（dào）申报产品检（jiǎn）测变量△△Ct的计算公式，依据这一计算公式可推（tuī）导出（chū）纯合缺失、杂合缺（quē）失和野生型的△△Ct理论值（或范围）；再结合（hé）目标（biāo）外显子与内参基因扩增效率（lǜ）差异（yì）以及SMN2不同拷贝数的影响，可对上（shàng）述△△Ct理论值（zhí）进行（háng）优化。结（jié）果显示纯合缺失、杂合缺失和野生（shēng）型的（de）△△Ct值（或范围）之间可设置合理的判断界值（zhí），因此理论上（shàng）该产品可分别检（jiǎn）测出三种基（jī）因（yīn）状态（tài）。但鉴于生产企业对杂合缺失与野生型之间的判断界值研究尚不透彻，再加（jiā）上缺乏可判定杂合（hé）缺失的对比方法等其（qí）他（tā）困难，本次注册申请的预（yù）期（qī）用途（tú）仅限于检测（cè）纯合突变（biàn），即SMA患者辅助诊（zhěn）断。

　　综上，SMN1基因外显子缺失（shī）检测（cè）在SMA疾病诊断（duàn）和SMA携带（dài）者筛查中具有重要的临床价值。然（rán）而到目前为止（zhǐ），受到技术水平的限制，相关的体外诊断试剂（jì）比（bǐ）较缺乏（fá），特别（bié）是可用于SMA携带者筛查的杂合缺失检测，尚（shàng）无适（shì）合的体外诊断试剂上市。（器审中心审评六部  何（hé）静云）

来（lái）源：中国医药报